Ni Seplife ®6FF (IDA) Affinitätschromatographisches Medium

Nickel-Chelat-Agarose-Chromatographieharz

Ni Seplife 6FF (IDA) Anleitung

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Affinitätschromatographisches Medium Produktprofil:

Ni-Chelat-Agarose-Chromatographie  (IDA) bindet Iminodiessigsäure auf 6FF-Agarose-Medien und chelatiert dann Ni2+-Ionen, um als  Affinitätschromatographiemedien Es wird häufig verwendet für die  Verarbeitung von Protein ,  Nukleinsäure  Und  Polypeptidreinigung  im Downstream von  Biopharmazie und Bioengineering .

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Affinitätschromatographisches Medienharz Parameter:

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Affinitätschromatographisches Medientestverfahren:

1.Säulenpackung
(1) Alle Materialien und Reagenzien bei Raumtemperatur, Vorbereitung des Anfangspuffers und des Elutionspuffers.
(2) Nehmen Sie eine Harzprobe entsprechend der Säulengröße, waschen Sie sie mit 20 % Ethanol aus, um sie zu trocknen, verwenden Sie einen Puffer (Verhältnis Harz: Puffer = 3:1), um sie zu homogenisieren und einer Entgasungsbehandlung zu unterziehen.
(3) Verwenden Sie Wasser oder Puffer, um das Innere oder den Boden der Säule feucht zu halten. Der Wasser- oder Pufferstand sollte höher sein als die Filtermembran und stellen Sie sicher, dass der Boden der Säule keine Unebenheiten aufweist.
(4) Führen Sie das Homogenat mit einem Glasstab entlang der Innenseite der Säule in die Säule ein, um Blasenbildung zu vermeiden. Öffnen Sie das Säulenauslassventil, damit sich das Harz ungehindert absetzen kann, und schließen Sie die Säulenkappe gut an.
(5) Öffnen Sie die Schlauchpumpe und lassen Sie den Puffer mit einer Flussrate durch die Säule fließen, die 1,33-mal höher ist als die Flussrate des normalen Puffers. Verwenden Sie 2-3BV-Puffer, um die Säule auszugleichen.
2. Gleichgewicht
Mit 2–5 Bettvolumina der ursprünglichen Pufferlösung ausgleichen, bis Leitfähigkeit, pH-Wert und andere Parameter unverändert bleiben.
3. Probenbeladung
(1) Die Probe wird im Allgemeinen im Anfangspuffer mit einem pH-Wert von 6–8 gelöst. Durch Erhöhen des pH-Werts des Ladepuffers kann die Beladung erhöht werden.
(2) Der Puffer sollte kein EDTA und Citrat enthalten und es ist am besten, Reduktionsmittel wie Mercaptoethanol und DTT zu vermeiden.
(3) Die üblicherweise verwendete Pufferlösung besteht aus 10 bis 100 mmol/l Natriumphosphat-Pufferlösung und 20 bis 200 mmol/l Tris-HCl-Pufferlösung.
(4) Um den Ionenaustausch zu verhindern, werden dem Puffer im Allgemeinen 0,15 bis 0,5 mol/l NaCl zugesetzt.
(5)Wenn Sie zum ersten Mal ein Nickelchelat-Agarosegel verwenden, wird empfohlen, 50 mmol/l PBS (50 mmol/l NaH2PO4, 0,5 mol/l NaCl, pH 7,4) als Anfangspuffer zu verwenden.
4.Elution
Die Elution wird im Allgemeinen in folgende Methoden unterteilt:
(1) Reduzieren Sie die Elution durch den pH-Wert: Die meisten Proteine ​​werden bei einem pH-Wert von 6–4 (auch bei einem pH-Wert von 3–4) eluiert, und als Puffer können Natriumacetat-, Zitronensäure- und Phosphatpuffersysteme verwendet werden.
(2)Kompetitive Elution: lineare oder zunehmende Konzentration konkurrierender Substanzen mit Affinität zu Metallionen (z. B. 0–0,5 mol/l Imidazol, 0–50 mmol/l Histidin, 0–2 mol/l NH4Cl).
(3) Elution durch Chelatbildner: Chelatbildner wie EDTA und EGTA können mit Metallionen reagieren und so das Protein eluieren. Diese Methode kann jedoch unterschiedliche Proteine ​​nicht trennen und beeinträchtigt die Adsorption der Proteine, wodurch das Fusionsprotein nicht haften bleibt.

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Affinitätschromatographisches Medium. Anmerkungen:

(1) Bei der ersten Verwendung wird empfohlen, bei Unsicherheit über die für die Elution erforderliche Imidazolkonzentration dem Ausgangspuffer 10 mmol/l, 20 mmol/l, 50 mmol/l, 100 mmol/l, 200 mmol/l oder 500 mmol/l zuzusetzen. Das Imidazol wurde von niedrig nach hoch eluiert und gesammelt, und die Elutionsergebnisse wurden mittels SDS-PAGE-Elektrophorese ermittelt.
(2) Das Imidazol ist alkalisch und der pH-Wert wird mit HCl eingestellt, nachdem der entsprechende Puffer hergestellt wurde.
(3) Durch die Senkung des pH-Werts und die Elution des Chelatbildners fallen die Metallionen ab und müssen vor der nächsten Verwendung erneut chelatiert werden.
(4) Unter bestimmten Bedingungen kann eine lineare Elution mit einem Imidazolgradienten durchgeführt werden, um die bevorzugten Elutionsbedingungen zu bestimmen.
Für die oben genannten Elutionsmethoden müssen dem Puffer 150 bis 500 mmol/L NaCl hinzugefügt werden, um den Ionenaustausch zu verhindern.
5.Regeneration
(1) Das Gel muss nach wiederholtem Gebrauch oder wenn die chelatisierten Metallionen ersetzt werden müssen, entnickelt und regeneriert werden. Methode zur Nickelentfernung: Spülen Sie die Säule zunächst mit 5 bis 10 Bettvolumina destilliertem Wasser, dann mit 5 bis 10 Bettvolumina 100 mmol/l EDTA und spülen Sie zum Schluss mit 2 bis 3 Bettvolumina 0,5 mol/l NaCl das restliche EDTA aus.
(2) Die mehrfach verwendete Säule muss nach der Nickelentfernung im Allgemeinen gereinigt werden. Reinigungsmethode: Die Säule mit 0,1–1,0 mol/l NaOH umkehren und 1–2 Stunden lang bei 50 cm/h halten. Dadurch werden nicht nur die starken Verunreinigungen, sondern auch die Wärmequelle entfernt.
(3) Erneute Chelatisierung von Metallionen nach der Reinigung. Chelatisierungsverfahren: Zunächst wird die Säule nach der Nickelentfernung mit 2 bis 5 Bettvolumina destilliertem Wasser vollständig äquilibriert. Anschließend werden 5 bis 10 Bettvolumina einer 0,1 bis 0,3 mol/l Metallsalzlösung zugeführt, um die Metallionen zu chelatieren. Anschließend wird mit 5 bis 10 Bettvolumina destilliertem Wasser gespült, um nicht chelatierte Metallionen zu entfernen.
6.KVP
(1) Entfernung adsorbierter Proteine ​​durch Ionenaustausch: 2 bis 3 Bettvolumina wurden mit 2 mol/L NaCl-Lösung zurückgespült.
(2) Entfernung stark hydrophober Proteine ​​und Lipide usw.: 4 Bettvolumina wurden mit 70 % Ethanol oder 30 % Isopropanol zurückgespült.
(3) Entfernung von ausgefälltem Protein, hydrophobem Protein: Referenz-Gel-Regenerationsschritt.
7.Lagerung
Versiegelt und bei 4–30 °C (20 % Ethanol in Aufbewahrungslösung) gelagert, trocken, belüftet, sauber, nicht gefroren; gebrauchte Säulen werden bei 4–8 °C in einer 20 %igen Ethanollösung gelagert.

Vorsicht:
(1)Die Probe und Ni seplife ®6FF (IDA) muss mit dem Elutionspuffer äquilibriert und dann zur Chromatographiesäule gelangen.
(2) Das Säulenbett muss flach, frei von Rillen und Luftblasen sein, andernfalls muss es neu installiert werden.
(3) Achten Sie bei der Verwendung darauf, dass die Temperatur der Säule und des Puffers gleich sind, um die Bildung von Blasen im Säulenbett zu vermeiden und den Reinigungseffekt zu beeinträchtigen.
(4) Die Durchflussrate sollte während des Elutionsprozesses streng kontrolliert werden und darf nicht zu hoch sein.
(5)Während der Beladung und des gesamten Elutionsvorgangs wird ein Austrocknen der Zylinderoberfläche verhindert.