Über Seplife ®Ionenaustauschchromatographie

Wie verwendet man Ionenaustauschchromatographieharze?

1. Betriebsmethode: 

Da Probe, Puffer und Eluent bei der biochemischen Trennung mobile Phasen sind, können sie beim Durchfließen der Säule getrennt werden. Daher kann im Säulenbetrieb ein Ionenaustausch und im chromatographischen Betrieb eine Trennung durchgeführt werden. Während des Trennvorgangs fließen die nicht adsorbierten Substanzen weiter aus dem Reaktionssystem, wodurch sich das Gleichgewicht kontinuierlich nach rechts verschiebt. Dies stellt eine Art dynamisches Gleichgewicht dar und wird daher auch als dynamischer Betrieb bezeichnet. Der dynamische Betriebsmodus bietet eine gute Trennwirkung, ist für alle Arten von Proben geeignet und ermöglicht einen kontinuierlichen Betrieb. Bei der chromatographischen Trennung hat der Beladungszustand der chromatographischen Säule einen gewissen Einfluss auf die Trennung. Die Harze sollten gleichmäßig in der Säule verteilt sein, das Vorhandensein von Luftblasen ist nicht zulässig und die Schichtung der Harze ist zu vermeiden.

Bei einigen Proben mit hoher Viskosität kann auch die „statische“ Behandlungsmethode zur vorläufigen Extraktion und Trennung verwendet werden. Die Ionenaustauscherharze und die zu behandelnde Arbeitsflüssigkeit werden im Reaktionsgefäß gerührt. Sobald das Adsorptionsgleichgewicht erreicht ist, werden die Harze und das Raffinat getrennt und zur Elution in eine Säule gegeben.

Dieses statische Batch-Verfahren zeichnet sich durch eine einfache Prozessausrüstung und leichte Bedienung aus. Beispielsweise wird bei der Vortrennung einiger Naturstoffe wie Heparin-Natrium häufig dieses statische Trennverfahren angewendet. 

Im statischen Trennmodus sollte die Rührgeschwindigkeit des Ionenaustauschers im Arbeitsmedium kontrolliert werden. Ist die Rührgeschwindigkeit zu hoch und die Scherkraft zu groß, zerbrechen die Ionenaustauscherpartikel, was das Filtern und Trennen erschwert. Ist die Geschwindigkeit zu niedrig, beeinträchtigt dies den Kontakt zwischen den Harzen und dem Arbeitsmedium und beeinflusst auch die Austauschrate.

2. Der Einfluss der Probe auf den Trenneffekt:

Um eine hohe Auflösung und hohe Belastbarkeit bei der biochemischen Trennung zu erreichen, sind auch die Vorbereitung und Leistung der Arbeitslösung sehr wichtige Faktoren. Die Viskosität und Klarheit der Arbeitsflüssigkeit beeinflussen nicht nur die Trennwirkung der Ionenaustauscherharze, sondern auch die Lebensdauer des Trennmediums.

Biochemische Trennungen sind oft relativ komplexe Prozesse, die viele Verunreinigungen enthalten, darunter nicht nur kleine Moleküle, sondern auch kolloidale Substanzen, Lipide usw. Insbesondere irreversibel adsorbierte Makromoleküle können die funktionellen Gruppen des Mediums bedecken oder dessen Poren verstopfen, was zu irreversiblen Verunreinigungen führt und die Lebensdauer des Trennmediums verkürzt. Daher sollte das Arbeitsmedium vor dem Trennvorgang so gut wie möglich vorbehandelt werden, um den Trenneffekt sicherzustellen.

Beim biochemischen Trennungs- und Reinigungsprozess werden einige Zielprodukte durch den Elutionsprozess entfernt oder das Zielprodukt bleibt aufgrund unvollständiger Elution auf dem Medium zurück, was zu Produktverlusten führt, die wiederum einen wichtigen Faktor für die Produktausbeute darstellen.

Gleichzeitig führen strukturelle Veränderungen im Protein zu einer Inaktivierung, die sich ebenfalls auf die Ausbeute auswirkt. Die Zugabe einiger Stabilisatoren oder Schutzmittel im Ionenaustauschprozess kann nicht nur die Ausbeute erhöhen, sondern auch die Selektivität des Trennmediums für Proteine ​​verbessern.

3. Der Einfluss der Durchflussrate auf den Trenneffekt:

Bei der Ionenaustauschchromatographie ist die Flussrate ein wichtiger Faktor, der den Trenneffekt beeinflusst. Um einen hervorragenden Trenneffekt zu erzielen, sollten Experimente basierend auf Faktoren wie der Art des Ionenaustauscherharzes, der Partikelgröße und der Molekularstruktur der Wirkstoffe im Arbeitsfluid durchgeführt werden, um bessere experimentelle Parameter zu ermitteln.

Wenn das Molekulargewicht des Zielprodukts relativ gering und die Porengröße des Mediums relativ groß ist, kann eine höhere Durchflussrate verwendet werden, da dies den Massentransfer begünstigt.

Wenn das Zielprodukt jedoch ein Biomakromolekül ist und die Porengröße des Mediums kleiner als die des getrennten Substanzmoleküls ist, sollte aufgrund der langsameren Diffusionsrate des Moleküls eine langsamere Durchflussrate gewählt werden.

Bei einer hohen Viskosität des Arbeitsmediums sollte aufgrund der geringeren Stoffübertragungsrate auch eine geringere Durchflussrate verwendet werden.

Die Durchflussrate beeinflusst nicht nur den Effekt der Austauschadsorption, sondern auch den Effekt der Elution. Normalerweise ist die Durchflussrate während der Elution langsamer als während der Ionenaustauschadsorption.

4. Die Elutionsmethoden der Ionenaustauschchromatographie:

Sobald das Zielprotein in der Probe vollständig an den Ionenaustauscher gebunden ist, sollte es eluiert werden. Das Grundprinzip besteht darin, ein Ion oder eine Gruppe zu verwenden, die aktiver als die Adsorptionssubstanz ist, um das Zielprodukt zu desorbieren, das ausgetauscht und an der Oberfläche und im Inneren des Mediumpartikels adsorbiert wird. Verschiedene Zielproteine ​​haben unterschiedliche Bindungsfähigkeiten an Ionenaustauscherharze. Daher sollte ein geeignetes Elutionsmittel gewählt werden, um das Protein aus dem Medium zu eluieren und die getrennten und gereinigten Produkte zu sammeln. Es gibt grob drei Elutionsmethoden für die Ionenaustauschchromatographie:

1) Simultane Elution: Das Elutionsmittel ist die gleiche Substanz und es kann eine verdünnte Säure, eine alkalische Lösung oder eine Salzlösung verwendet werden oder es kann ein geeignetes organisches Lösungsmittel verwendet werden, wobei die Salzlösung das wichtigste ist. Die Auswahl erfolgt entsprechend den Eigenschaften des Zielprodukts und der Dosierungsform des Endprodukts. 

Da die adsorbierten Substanzen oft nicht vom gleichen Typ sind, unterscheiden sich die Ladungen der verschiedenen Substanzen und ihre Bindungsstärke an das Medium. Selbst bei Verwendung des gleichen Eluenten fließen die leicht austauschbaren Substanzen zuerst aus dem Medium heraus, wodurch die Bindungskraft stärker wird. Nach dem Herausfließen der Substanzen können diese, sofern sie durch Klassifizierung gesammelt werden, getrennt und relativ reine Produkte erhalten werden.

Diese Methode wird hauptsächlich zur Trennung verwendet, wenn die Eigenschaften des Zielprodukts gut bekannt sind, oder zur Trennung analytischer Arten.

2) Schrittweise Elution: Die Elution erfolgt mit unterschiedlich konzentrierten Salzlösungen. Während der Austauschadsorption des Trennmediums werden verschiedene Proteine ​​adsorbiert. Bei konstanten Elutionsbedingungen können manchmal nicht alle Komponenten richtig getrennt werden, sodass die Elutionsbedingungen geändert werden müssen.

Die Änderung kann stufenweise erfolgen. Das bedeutet, dass unterschiedliche Eluenten oder Eluenten mit unterschiedlichen pH-Werten für die Elution stufenweise ausgewählt werden. Je nach Konzentration und Säuregrad des Eluenten können unterschiedliche Elutionspeaks erzielt werden. Das heißt, eine bestimmte Salzkonzentration kann ein bestimmtes Zielprotein erzeugen, während unterschiedliche Salzkonzentrationen unterschiedliche Zielproteine ​​erzeugen.

Dieses schrittweise Elutionsverfahren eignet sich zur Trennung von Proteinen mit bekannten Eigenschaften, insbesondere für die Produktion im großen Maßstab, und ist einfach zu bedienen und zu steuern.

3) Gradientenelution, d. h. Änderung der Ionenstärke oder des pH-Werts des Eluenten entsprechend einer bestimmten linearen Änderung (im Allgemeinen wird die Elutionsmethode zur Änderung des pH-Werts nur in Sonderfällen verwendet). Während der schrittweisen Änderung des Eluenten können verschiedene Proteine ​​nacheinander ersetzt und verschiedene Proteinkomponenten erhalten werden. 

Gleichzeitig bilden Proteine ​​im Allgemeinen keinen Schwanz. Die Gradientenelution ist die am häufigsten verwendete Elutionsmethode in der Ionenaustauschchromatographie und auch die Elutionsmethode mit der stärksten Elutionsfähigkeit, die für die Elution von Komponenten mit ähnlichen Ladungseigenschaften geeignet ist.

Beim Elutionsprozess kann sowohl die Gleichstrom- als auch die Gegenstromelution angewendet werden. Bei der Gleichstromelution ist die Fließrichtung des Eluenten mit der des Arbeitsmediums identisch. Bei der Gegenstromelution (auch Rückwärtselution genannt) ist die Fließrichtung des Eluenten entgegengesetzt zur Arbeitslösung.

Wenn die Zulaufflüssigkeit von oben nach unten durch die Austauschsäule ausgetauscht und adsorbiert wird, ist die Konzentration des Adsorbats in der oberen Schicht der Austauschsäule höher als in der unteren Schicht. Durch die umgekehrte Desorption des Eluenten von unten nach oben kann die Elution effizienter erfolgen. Da die umgekehrte Elution jedoch deutlich komplizierter ist als die Gleichstromelution, wird heute meist die Gleichstromelution verwendet.

Desinfektion von Ionenaustauschchromatographieharzen:

Bei der Herstellung einiger biochemischer Produkte mit hohen Reinheitsanforderungen ist es häufig erforderlich, das Trennmedium zu sterilisieren, um zu verhindern, dass sich Verunreinigungen wie Mikroorganismen in das Zielprodukt vermischen.

Die Hochtemperaturdesinfektion ist die am häufigsten verwendete Methode. Die meisten Ionenaustauscher weisen derzeit stabile physikalische und chemische Eigenschaften auf und können einer Hochtemperaturdesinfektion unterzogen werden. Bei der Verwendung von Polysaccharidmedien ist jedoch zu beachten, dass das Medium salzhaltig sein muss und die Hochtemperaturdesinfektion unter neutralen Bedingungen durchgeführt werden muss. Andernfalls führt dies zum Abbau der makromolekularen Polysaccharidmatrix, was die Lebensdauer des Mediums erheblich beeinträchtigt.

NaOH ist ebenfalls ein gutes Desinfektionsmittel. Die geeignete NaOH-Konzentration sollte jedoch entsprechend der Alkalibeständigkeit des Mediums sowie der Art und dem Grad der mikrobiellen Kontamination gewählt werden. Bei der NaOH-Desinfektion kann auch eine Säulentränkung durchgeführt werden. Dabei wird eine bestimmte NaOH-Konzentration in die Säule geleitet, das Flüssigkeitsauslassventil geschlossen und die Säule mehrere Stunden lang eingeweicht, um die Desinfektion zu erreichen. Die Kombination von NaOH mit Ethanol führt zu besseren Ergebnissen. Bei der NaOH-Desinfektion können Desinfektion und CIP kombiniert werden. 

Lagerung von Ionenaustausch-Chromatographieharzen:

Alle Arten von Chromatographieharzen sollten vor der Lagerung nach Gebrauch gereinigt werden. Dies ist besonders wichtig für Polysaccharid-Trennmedien.

Nachdem das Trennmedium verwendet wurde, waschen Sie es mit 2 CV Wasser und lassen Sie es dann mit 2 Bettvolumina 20%igem Ethanol durch die Säule laufen. Bei stark sauren kationischen SP-Medien waschen Sie mit einer 20%igen Ethanollösung, die 0,2 mol/l Natriumacetat enthält, und waschen Sie dann bei langsamerer Durchflussrate mit einer entgasten Ethanol-Wasser-Lösung.

Nach der Behandlung kann es bei Raumtemperatur oder für längere Zeit bei 4–8 °C gelagert werden. Die Chromatographiesäule muss während der Lagerung vollständig versiegelt sein, um ein Verdampfen der Feuchtigkeit und ein Austrocknen der Säule zu verhindern.

Das vorerst nicht verwendete Medium muss in einer 20%igen Ethanollösung aufbewahrt werden. Alle Ionenaustausch-Trennmedien sollten bei 4 °C bis 30 °C gelagert und vor Frost geschützt werden.

Der Prozess der Trennung und Reinigung biologischer Makromoleküle mittels Ionenaustauschchromatographie basiert hauptsächlich auf der Dissoziation verschiedener Moleküle, der Nettoladung von Ionen und der elektrischen Differenz in der Oberflächenladungsverteilung zur selektiven Trennung. Es hat sich zu einer der am häufigsten verwendeten Reinigungstechniken bei der Trennung und Reinigung biochemischer Produkte, Proteine, Peptide und anderer Substanzen entwickelt.

Seplife ® Dextranbasierte Ionenaustauschchromatographieharze:

Das Seplife ® Dextran-Ionenaustausch-Chromatographieharze verwenden die Dextranmatrix von Gelfiltrations-Chromatographieharzen der G-Serie (Seplife G-25 und Seplife G-50), und die Ionenaustausch-Funktionsliganden mit unterschiedlichen Eigenschaften sind fest an die vernetzte Dextranmatrix gebunden.

Dextran-Ionenaustauscherharze werden üblicherweise in Form von trockenem Pulver gelagert, das vor Gebrauch aufgequollen werden muss. Es wird häufig in niedermolekularen Proteinen wie Prothrombin und niedermolekularem Heparin verwendet.

Sunresins Dextran-Ionenaustausch-Chromatographieharze:

DEAE Seplife ® A25/A50

Q Seplife ® A25/A50

CM Seplife ® C25/C50

SP Seplife ® C25/C50

Seplife ® Ultraschneller Fluss Agarose-basierter Ionenaustauschchromatographieharze (BB):

Diese Serie von Seplife ®Ionenaustauschchromatographieharze werden durch Bindung von Ionenaustauschliganden an Agarose-Mikrokügelchen mit einer Partikelgröße von 100–300 µm hergestellt. Der Gegendruck ist bei der Durchflussrate relativ gering. Bei Proben mit hoher Viskosität und Trübung kann die Verwendung dieser Harzreihe die Effizienz verbessern.

Sunresin – Agarose-Ionenaustausch-Chromatographieharze mit ultraschneller Durchflussrate:

DEAE Seplife ®  BB

Q Seplife ®  BB

CM Seplife ®  BB

SP Seplife ®  BB

Seplife ®  Auf Agarose basierende Ionenaustauschchromatographieharze (FF) mit schnellem Durchfluss:

Diese Serie von Seplife ®  Harze verwenden 45–165 µm große Agarose-Mikrokügelchen als Matrix, die mit verschiedenen funktionellen Gruppen verbunden sind. Der geeignete Partikelgrößenbereich ermöglicht ein breiteres Anwendungsspektrum. Es wird häufig in verschiedenen Phasen der Erfassung, Zwischenreinigung und Verfeinerung biologischer Produkte eingesetzt.

Sunresin Fast Flow Agarose-Ionenaustauschchromatographieharze:

DEAE Seplife ®  FF

Q Seplife ®  FF

CM Seplife ®  FF

SP Seplife ®  FF

Seplife ®  Hochauflösende Ionenaustauschchromatographieharze auf Agarosebasis (HP):

Diese Serie verwendet 25–45 µm große Agarose-Mikrokügelchen als Matrix und wird durch die Bindung verschiedener funktioneller Gruppen hergestellt.

Die geringe Partikelgröße ermöglicht den Harzen eine höhere Auflösung und sie werden häufig zur Feintrennung und Vorbereitung kleiner Probenmengen verwendet.

Sunresins hochauflösende Agarose-Ionenaustausch-Chromatographieharze:

DEAE Seplife ®  HP

Q Seplife ®  HP

CM Seplife ®  HP

SP Seplife ®  HP

Agarose-Ionenaustauschchromatographieharze mit ultrahoher Kapazität (XL): 

Das spezielle „Tentakel“-Design der Agarose-Mikrokügelchen verringert den Einfluss sterischer Hinderung bei der Bindung an Biomoleküle und die Liganden werden besser verteilt, was eine ultrahohe Beladung und eine hohe Kosteneffizienz ermöglicht.

Sunresins Agarose-Ionenaustausch-Chromatographieharze mit ultrahoher Kapazität:

DEAE Seplife ®  XL

Q Seplife ®  XL

CM Seplife ®  XL

SP Seplife ®  XL

Seplife ®  Hochfeste Agarose-Ionenaustauschchromatographieharze (großer Maßstab):

Das hochfeste (großmaßstäbliche) Agarose-Ionenaustauschmedium von Sunresin weist eine maximale Druckbeständigkeit von 0,5 MPa, eine maximale Durchflussrate von 1000 cm/h und eine schnellere Massenübertragungsrate auf, was eine deutlich verbesserte Effizienz bei der Produktion im großen Maßstab ermöglicht.

Entsprechend der Partikelgröße der Matrix wird das hochfeste Agarose-Ionenaustauschmedium von Sunresin in ein Medium mit hoher Steifigkeit und hoher Durchflussrate (Großmaßstab) und ein Medium mit hoher Steifigkeit und hoher Auflösung (Großmaßstab HP) unterteilt. 

Sunresin – Agarose-Ionenaustausch-Chromatographieharze mit hoher Steifigkeit (großer Maßstab): 

DEAE Großmaßstab /HP

Q Großformat /HP

CM Großmaßstab /HP

SP Großmaßstab /HP

Seplife ®  Polystyrol-Ionenaustauschchromatographieharze mit einheitlicher Partikelgröße (LXMS):

Seplife ® IEX LXMS-Ionenaustauschchromatographieharze bieten zwei Porengrößen (50 nm, 150 nm) und drei Partikelgrößen (15, 30 und 50 µm) aus Polystyrolharzen mit einheitlicher Partikelgröße. Dank ihrer hohen Vernetzungseigenschaften halten die Harze einem höheren Betriebsdruck (3 MPa) stand.

Die beiden Porengrößen von 50 nm und 150 nm decken die Anwendung der Erfassung, Zwischenreinigung und Feinreinigung von Antikörpern, Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Antibiotika, Naturprodukten und anderen Produkten mit unterschiedlichen Molekulargewichten ab.

Sunresin – Polystyrol-Ionenaustauschchromatographieharze mit einheitlicher Partikelgröße:

Seplife ®  LXMS 15Q/15S (Partikelgröße 15µm, Porengröße 50nm)

Seplife ®  LXMS 30Q/30S (Partikelgröße 30µm, Porengröße 50nm)

Seplife ®  LXMS 50Q/50S (Partikelgröße 50µm, Porengröße 100nm)

Seplife ®  LXMS 50HQ/50HS (Partikelgröße 50µm, Porengröße 150nm)

Seplife ®  Polymethylacrylat-Ionenaustauschchromatographieharze (LXPM):

Diese Gruppe von Ionenaustausch-Chromatographieharzen besteht aus Mikrokügelchen mit Polymethacrylat als Matrix, die mithilfe der einzigartigen Polymersynthesetechnologie von Sunresin hergestellt werden. Die Mikrokügelchen werden durch präzise Porenbildungstechnologie und hydrophile langkettige Makromoleküle an der Oberfläche modifiziert und mit verschiedenen Ionenaustauschgruppen gekoppelt.

Dank ihrer guten Hydrophilie, ihrer guten chemischen und physikalischen Stabilität und ihrer starren Struktur weisen die Ionenaustausch-Chromatographieharze eine gute Biokompatibilität und Lebensdauer auf und verbessern die Reinigungseffizienz. Sie decken die Anwendung in Produktions- und Reinigungsstufen wie der Erfassung, Zwischenreinigung und Feinreinigung von Molekülen wie Antikörpern, Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Antibiotika und Naturprodukten ab und bieten Kunden eine Gesamtlösung für die industrielle Produktion biologischer Proben.

Sunresin – Polymethylacrylat-Ionenaustausch-Chromatographieharze:

Seplife ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 650M (starke Hydrophilie, Partikelgröße 80 µm ）

Seplife ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 650S (starke Hydrophilie, Partikelgröße 50 µm ）

Seplife ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 706 (starke Hydrophobie ，stark ionisch multimodal, Partikelgröße 80 µm ）

Seplife ®  LXPM CM/DEAE/SP/Q 5504 （starke Hydrophobie ，hohe Auflösung, starke ionische Multimodalität, Partikelgröße 80 µm)

Für weitere Informationen zu den verschiedenen Arten von Ionenaustauschchromatographieharzen kontaktieren Sie uns bitte unter (info.lifescience@sunresin.com).