Ni Seplife ®6FF (IDA) Affinitätschromatographische Medien

Nickelchelatbildendes Agarose-Chromatographieharz

Ni Seplife 6FF (IDA) Anleitung

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Affinity Chromatographic Media Produktprofil:

Ni-Chelat-Agarose-Chromatographie  (IDA) bindet Iminodiessigsäure auf 6FF-Agarose-Medien und chelatisiert dann das Ion von Ni2+, um als ein zu wirken  Affinitätschromatographische Medien . Es wird häufig für die verwendet  Verarbeitung von Proteinen ,  Nukleinsäure  Und  Polypeptidreinigung  im stromabwärts von  Biopharmazeutik und Biotechnik .

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Affinitätschromatographische Medienharzparameter:

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Affinity Chromatographic Media Testanleitung:

1. Säulenverpackung
(1) Das gesamte Material und die Reagenzien bei Raumtemperatur aufbewahren und den Anfangspuffer und den Elutionspuffer vorbereiten.
(2) Nehmen Sie eine Harzprobe entsprechend der Säulengröße, waschen Sie sie zum Trocknen mit 20 % Ethanol aus, verwenden Sie Puffer (Verhältnis Harz : Puffer = 3:1) zur Homogenisierung und Entgasungsbehandlung.
(3) Verwenden Sie Wasser oder Puffer, um das Innere oder den Boden der Säule feucht zu halten. Der Wasser- oder Pufferstand sollte höher als die Filtermembran sein und sicherstellen, dass der Boden der Säule keine Blasen aufweist.
(4) Führen Sie das Homogenat mit einem Glasstab entlang der Innenseite der Säule einmal in die Säule, um Blasen zu vermeiden. Öffnen Sie das Säulenauslassventil, damit sich das Harz ungehindert absetzen kann, und schließen Sie die obere Kappe der Säule gut an.
(5) Öffnen Sie die peristaltische Pumpe und lassen Sie den Puffer mit einer Flussrate durch die Säule laufen, die 1,33-mal höher ist als die Flussrate des bei normaler Verwendung verwendeten Puffers. Verwenden Sie einen 2-3BV-Puffer, um das Säulengleichgewicht herzustellen.
2.Gleichgewicht
Mit 2–5 Bettvolumina anfänglicher Pufferlösung ausgleichen, bis Leitfähigkeit, pH-Wert und andere Parameter unverändert sind.
3. Laden der Probe
(1) Die Probe wird im Allgemeinen im anfänglichen Puffer mit einem pH-Wert von 6–8 gelöst, und eine Erhöhung des pH-Werts des Ladepuffers kann die Beladung erhöhen.
(2) Der Puffer sollte kein EDTA und Citrat enthalten und es ist am besten, Reduktionsmittel wie Mercaptoethanol und DTT zu vermeiden.
(3) Die üblicherweise verwendete Pufferlösung enthält 10 bis 100 mmol/L Natriumphosphat-Pufferlösung und 20 bis 200 mmol/LTris-HCl-Pufferlösung.
(4) Dem Puffer werden im Allgemeinen 0,15 bis 0,5 mol/L NaCl zugesetzt, um den Ionenaustausch zu verhindern.
(5)Bei der erstmaligen Verwendung eines Nickel-Chelat-Agarose-Gels wird empfohlen, 50 mmol/L PBS (50 mmol/L NaH2PO4, 0,5 Mol/L NaCl, pH 7,4) als Anfangspuffer zu verwenden.
4.Elution
Die Elution wird im Allgemeinen in die folgenden Methoden unterteilt:
(1) Reduzieren Sie die pH-Elution: Die meisten Proteine ​​werden bei pH 6–4 (auch bei pH 3–4) eluiert, und der Puffer kann Natriumacetat-, Zitronensäure- und Phosphatpuffersysteme sein.
(2)Kompetitive Elution: lineare Erhöhung oder Erhöhung der Konzentration konkurrierender Substanzen mit Affinität zu Metallionen (z. B. 0–0,5 mol/L Imidazol, 0–50 mmol/L Histidin, 0–2 mol/L NH4Cl).
(3) Chelatbildner-Elution: Chelatbildner wie EDTA und EGTA können mit Metallionen reagieren und so zur Elution des Proteins führen. Diese Methode kann jedoch verschiedene Proteine ​​nicht trennen und beeinträchtigt die Adsorption von Proteinen, was dazu führt, dass das Fusionsprotein nicht hängen bleiben kann.

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Affinitätschromatographische Medien Anmerkungen:

(1) Wenn bei der ersten Verwendung die für die Elution erforderliche Imidazolkonzentration unsicher ist, wird empfohlen, 10 mmol/L, 20 mmol/L, 50 mmol/L, 100 mmol/L, 200 mmol/L, 500 mmol/L hinzuzufügen der Anfangspuffer. Das Imidazol wurde von niedrig nach hoch eluiert und gesammelt, und die eluierten Ergebnisse wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese identifiziert.
(2) Das Imidazol ist alkalisch und der pH-Wert wird mit HCl eingestellt, nachdem der entsprechende Puffer hergestellt wurde.
(3) Eine Senkung des pH-Werts bei der Elution und die Elution des Chelatbildners führen dazu, dass die Metallionen abfallen und die Metallionen vor der nächsten Verwendung erneut chelatisiert werden müssen.
(4) Unter bestimmten Bedingungen kann eine lineare Imidazol-Gradientenelution durchgeführt werden, um die bevorzugten Elutionsbedingungen zu bestimmen.
Für die oben genannten Elutionsmethoden müssen dem Puffer 150 bis 500 mmol/L NaCl zugesetzt werden, um den Ionenaustausch zu verhindern.
5.Regeneration
(1) Das Gel muss nach wiederholtem Gebrauch oder wenn es notwendig ist, die chelatisierten Metallionen zu ersetzen, entnickelt und regeneriert werden. Methode zur Nickelentfernung: Spülen Sie die Säule zunächst mit 5 bis 10 Bettvolumina destilliertem Wasser, dann spülen Sie die Säule mit 5 bis 10 Bettvolumina 100 mmol/l EDTA und verwenden Sie schließlich 2 bis 3 Bettvolumina 0,5 mol/l NaCl-Waschlösungen Entfernen Sie restliches EDTA.
(2) Die mehrfach verwendete Säule muss im Allgemeinen nach der Nickelentfernung gereinigt werden. Reinigungsmethode: Drehen Sie die Säule mit 0,1–1,0 mol/L NaOH um, halten Sie sie 1–2 Stunden lang bei 50 cm/h, um nicht nur die starken Verunreinigungen zu entfernen, sondern auch die Wärmequelle zu entfernen.
(3)Rechelatierung von Metallionen nach der Reinigung. Chelatisierungsmethode: Zuerst wird die Säule nach der Nickelentfernung vollständig mit 2 bis 5 Bettvolumina destilliertem Wasser äquilibriert, und dann werden 0,1 bis 0,3 Mol/L Metallsalzlösung verwendet, um 5 bis 10 Bettvolumina zu chelatisieren. Mit 5 bis 10 Bettvolumina destilliertem Wasser spülen, um nicht chelatisierte Metallionen zu entfernen.
6.CIP
(1) Entfernung von durch Ionenaustausch adsorbierten Proteinen: 2 bis 3 Bettvolumina wurden mit 2 mol/L NaCl-Lösung zurückgewaschen.
(2) Entfernung stark hydrophober Proteine ​​und Lipide usw.: 4 Bettvolumina wurden mit 70 % Ethanol oder 30 % Isopropanol zurückgewaschen.
(3)Entfernung von ausgefälltem Protein und hydrophobem Protein: Referenzgel-Regenerationsschritt.
7. Lagerung
Versiegelt und bei 4–30 °C gelagert (20 % Ethanol in der Aufbewahrungslösung), trocken, belüftet, sauber, nicht gefroren; Gebrauchte Säulen werden in einer 20 %igen Ethanollösung bei 4–8 °C gelagert.

Vorsicht:
(1) Die Probe und das Ni-Seplife ®6FF (IDA) muss mit dem Elutionspuffer äquilibriert werden und dann zur Chromatographiesäule gelangen.
(2) Das Säulenbett muss flach und frei von Rillen und Luftblasen sein, andernfalls sollte es neu installiert werden.
(3) Stellen Sie bei der Verwendung sicher, dass die Temperatur der Säule und des Puffers gleich ist, um die Bildung von Blasen im Säulenbett und eine Beeinträchtigung des Reinigungseffekts zu vermeiden.
(4) Die Flussrate sollte während des Elutionsprozesses streng kontrolliert werden und nicht zu schnell sein.
(5)Während der Beladung und des gesamten Elutionsprozesses wird ein Austrocknen der Zylinderoberfläche verhindert.