Über Seplife ®Ionenaustauschchromatographie
Wie verwendet man Ionenaustauscher-Chromatographieharze?
1. Vorgehensweise:
Da Probe, Puffer und Eluent bei der biochemischen Trennung mobile Phasen darstellen, können sie während des Säulendurchlaufs getrennt werden. Daher kann der Ionenaustausch im Säulenbetrieb und die Trennung in chromatographischer Form erfolgen. Während des Trennprozesses fließen die nicht adsorbierten Substanzen kontinuierlich aus dem Reaktionssystem ab, wodurch sich das Gleichgewicht stetig nach rechts verschiebt. Dies ist ein dynamisches Gleichgewicht, weshalb dieser Vorgang auch als dynamischer Betrieb bezeichnet wird. Der dynamische Betriebsmodus bietet eine gute Trennwirkung, eignet sich für alle Arten von Proben und ermöglicht einen kontinuierlichen Betrieb. Bei der chromatographischen Trennung hat die Beladung der Chromatographiesäule einen gewissen Einfluss auf die Trennung. Die Harze sollten gleichmäßig in der Säule verteilt sein, Lufteinschlüsse und eine Schichtung der Harze sind zu vermeiden.
Bei einigen Proben mit hoher Viskosität kann die „statische “Behandlungsmethode auch zur Vorextraktion und -trennung eingesetzt werden. Die Ionenaustauscherharze und die zu behandelnde Arbeitsflüssigkeit werden im Reaktionsgefäß gerührt. Nach Erreichen des Adsorptionsgleichgewichts werden die Harze und das Raffinat abgetrennt und zur Elution auf eine Säule aufgetragen.
Dieses statische Batch-Verfahren zeichnet sich durch einfache Anlagentechnik und unkomplizierte Bedienung aus. Beispielsweise wird dieses statische Trennverfahren häufig zur Vortrennung einiger Naturprodukte wie Heparin-Natrium eingesetzt.
Im statischen Trennmodus muss die Rührgeschwindigkeit des Ionenaustauschers im Arbeitsmedium präzise gesteuert werden. Ist die Rührgeschwindigkeit zu hoch und die Scherkraft zu groß, werden die Ionenaustauscherpartikel zerstört, was die Filtration und Trennung erschwert. Ist die Geschwindigkeit hingegen zu niedrig, wird der Kontakt zwischen Harz und Arbeitsmedium beeinträchtigt, was sich negativ auf die Austauschrate auswirkt.
2. Der Einfluss der Sonde auf den Trenneffekt:
Um eine hohe Auflösung und Beladungskapazität für die biochemische Trennung zu erzielen, sind die Herstellung und die Eigenschaften der Arbeitslösung von entscheidender Bedeutung. Viskosität und Klarheit der Arbeitsflüssigkeit beeinflussen nicht nur die Trennleistung der Ionenaustauscherharze, sondern auch die Lebensdauer des Trennmediums.
Die biochemische Trennung ist oft ein relativ komplexes System, das zahlreiche Verunreinigungen enthält, darunter nicht nur kleine Moleküle, sondern auch kolloidale Substanzen, Lipide usw. Insbesondere können irreversibel adsorbierte Makromoleküle die funktionellen Gruppen des Mediums bedecken oder deren Poren verstopfen, was zu irreversibler Kontamination und einer verkürzten Lebensdauer des Trennmediums führt. Daher sollte das Arbeitsmedium vor dem Trennvorgang so weit wie möglich vorbehandelt werden, um einen optimalen Trenneffekt zu gewährleisten.
Bei der biochemischen Trennung und Reinigung werden einige Zielprodukte durch den Elutionsprozess entfernt, oder das Zielprodukt verbleibt aufgrund unvollständiger Elution im Medium, was zu Produktverlusten führt, die einen wichtigen Faktor für die Produktausbeute darstellen.
Gleichzeitig führen Strukturveränderungen des Proteins zu dessen Inaktivierung, was sich ebenfalls auf die Ausbeute auswirkt. Die Zugabe von Stabilisatoren oder Schutzmitteln im Ionenaustauschprozess kann nicht nur die Ausbeute erhöhen, sondern auch die Selektivität des Trennmediums für Proteine verbessern.
3. Der Einfluss der Durchflussrate auf den Trenneffekt:
Bei der Ionenaustauschchromatographie ist die Flussrate ein wichtiger Faktor, der den Trenneffekt beeinflusst. Um eine optimale Trennung zu erzielen, sollten Experimente durchgeführt werden, die Faktoren wie die Art des Ionenaustauscherharzes, die Partikelgröße und die Molekularstruktur der Wirkstoffe im Arbeitsmedium berücksichtigen, um bessere experimentelle Parameter zu ermitteln.
Ist das Molekulargewicht des Zielprodukts relativ klein und die Porengröße des Mediums relativ groß, kann eine höhere Durchflussrate verwendet werden, da dies den Stofftransport begünstigt.
Wenn es sich bei dem Zielprodukt jedoch um ein Biomakromolekül handelt und die Porengröße des Mediums kleiner ist als die des zu trennenden Substanzmoleküls, sollte aufgrund der langsameren Diffusionsgeschwindigkeit des Moleküls eine langsamere Flussrate gewählt werden.
Bei höherer Viskosität des Arbeitsmediums sollte aufgrund der geringeren Stoffaustauschrate auch eine niedrigere Durchflussrate gewählt werden.
Die Flussrate beeinflusst nicht nur den Effekt der Austauschadsorption, sondern auch den der Elution. Üblicherweise ist die Flussrate während der Elution geringer als während der Ionenaustauschadsorption.
4. Die Elutionsmethoden der Ionenaustauschchromatographie:
Wenn das Zielprotein in der Probe vollständig an den Ionenaustauscher gebunden ist, muss es eluiert werden. Das Grundprinzip besteht darin, ein Ion oder eine Gruppe zu verwenden, die reaktiver als die Adsorptionssubstanz ist, um das ausgetauschte und an der Oberfläche und im Inneren des Mediumpartikels adsorbierte Zielprodukt zu desorbieren. Unterschiedliche Zielproteine weisen unterschiedliche Bindungsaffinitäten zu Ionenaustauscherharzen auf. Daher muss ein geeignetes Elutionsmittel ausgewählt werden, um das Protein aus dem Medium zu eluieren und die abgetrennten und gereinigten Produkte zu sammeln. Es gibt im Wesentlichen drei Elutionsmethoden für die Ionenaustauschchromatographie:
1) Simultane Elution: Als Elutionsmittel dient die gleiche Substanz. Es können verdünnte Säuren, Laugen oder Salzlösungen verwendet werden, oder es kann ein geeignetes organisches Lösungsmittel verwendet werden, wobei Salzlösungen am häufigsten zum Einsatz kommen. Die Wahl des Elutionsmittels orientiert sich an den Eigenschaften des Zielprodukts und der Darreichungsform des Endprodukts.
Da die adsorbierten Substanzen oft nicht einheitlich sind, unterscheiden sich ihre Ladungen und ihre Bindungsstärke zum Medium. Selbst bei Verwendung desselben Elutionsmittels diffundieren die leicht austauschbaren Substanzen zuerst aus dem Medium, da ihre Bindungskraft stärker ist. Nach dem Ausfließen der Substanzen können diese durch Klassifizierung getrennt und relativ reine Produkte gewonnen werden.
Dieses Verfahren wird hauptsächlich zur Trennung eingesetzt, wenn die Eigenschaften des Zielprodukts gut bekannt sind, oder zur Trennung analytischer Art.
2) Stufenweise Elution: Hierbei wird die Elution mit Salzlösungen unterschiedlicher Konzentration durchgeführt. Während des Adsorptionsaustauschs im Trennmedium werden verschiedene Proteine adsorbiert. Bei konstanten Elutionsbedingungen lassen sich mitunter nicht alle Komponenten vollständig trennen, sodass die Elutionsbedingungen angepasst werden müssen.
Die Änderung kann stufenweise erfolgen, dh, verschiedene Eluenten oder Eluenten mit unterschiedlichen pH-Werten werden für die Elution in mehreren Schritten ausgewählt. Je nach Konzentration und Säuregrad des Eluenten lassen sich unterschiedliche Elutionspeaks erzielen. Das heißt, mit einer bestimmten Salzkonzentration kann ein bestimmtes Zielprotein isoliert werden, und mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen lassen sich verschiedene Zielproteine isolieren.
Diese schrittweise Elutionsmethode eignet sich zur Trennung von Proteinen mit bekannten Eigenschaften, insbesondere für die Produktion im großen Maßstab, und ist einfach zu bedienen und zu kontrollieren.
3) Gradientenelution, dh die Änderung der Ionenstärke oder des pH-Werts des Elutionsmittels in einem bestimmten linearen Verlauf (die pH-Wert-Änderung wird in der Regel nur in besonderen Fällen angewendet). Durch die schrittweise Änderung des Elutionsmittels können verschiedene Proteine nacheinander ausgetauscht und so unterschiedliche Proteinkomponenten gewonnen werden.
Gleichzeitig bilden Proteine im Allgemeinen keine Ausläufer. Die Gradientenelution ist die am häufigsten verwendete Elutionsmethode in der Ionenaustauschchromatographie und zugleich diejenige mit der stärksten Elutionsfähigkeit; Sie eignet sich daher zur Elution von Komponenten mit ähnlichen Ladungseigenschaften.
Beim Elutionsprozess können sowohl Gleichstrom- als auch Gegenstromelution eingesetzt werden. Bei der Gleichstromelution fließt das Elutionsmittel in die gleiche Richtung wie die Arbeitslösung. Bei der Gegenstromelution, auch Umkehrelution genannt, fließt das Elutionsmittel entgegengesetzt zur Arbeitslösung.
Wird die Speiseflüssigkeit in der Austauschkolonne von oben nach unten ausgetauscht und adsorbiert, ist die Adsorbatkonzentration in der oberen Schicht höher als in der unteren. Die anschließende Desorption des Eluenten von unten nach oben ermöglicht eine effizientere Elution. Da die umgekehrte Elution jedoch deutlich komplexer ist als die Gleichstromelution, wird heutzutage meist die Gleichstromelution eingesetzt.
Desinfektion von Ionenaustauscher-Chromatographieharzen:
Bei der Herstellung einiger biochemischer Produkte mit hohen Reinheitsanforderungen ist es oft erforderlich, die Trennmedien zu sterilisieren, um zu verhindern, dass Verunreinigungen wie Mikroorganismen in das Zielprodukt gelangen.
Die Desinfektion bei hohen Temperaturen ist die üblichste Methode. Die meisten Ionenaustauscher weisen derzeit stabile physikalische und chemische Eigenschaften auf und eignen sich für die Desinfektion bei hohen Temperaturen. Bei der Verwendung von Polysaccharidmedien ist jedoch zu beachten, dass diese salzhaltig sein und die Desinfektion bei hohen Temperaturen unter neutralen Bedingungen erfolgen muss. Andernfalls kommt es zum Abbau der Polysaccharid-Makromolekülmatrix, was die Lebensdauer der Medien erheblich beeinträchtigt.
NaOH ist ebenfalls ein gutes Desinfektionsmittel. Die geeignete NaOH-Konzentration sollte jedoch entsprechend der Alkalibeständigkeit des Mediums sowie der Art und dem Ausmaß der mikrobiellen Kontamination gewählt werden. Bei der Desinfektion mit NaOH kann auch die Säulenbehandlung angewendet werden: Dabei wird eine bestimmte NaOH-Konzentration in die Säule geleitet, das Auslassventil geschlossen und die Lösung mehrere Stunden einwirken gelassen, um die Desinfektion zu erreichen. Die Kombination von NaOH mit Ethanol führt zu besseren Ergebnissen. Die Desinfektion mit NaOH kann mit der CIP-Reinigung kombiniert werden.
Lagerung von Ionenaustauscher-Chromatographieharzen:
Alle Arten von Chromatographieharzen sollten vor der Lagerung gereinigt werden. Dies ist besonders wichtig für Trennmedien für Polysaccharide.
Nach Gebrauch des Trennmediums wird dieses mit 2 Säulenvolumina Wasser gewaschen und anschließend mit 2 Säulenvolumina 20%igem Ethanol durch die Säule geleitet. Bei stark sauren kationischen Trennmedien wird zunächst mit einer 20%igen Ethanollösung, die 0,2 mol/L Natriumacetat enthält, und anschließend mit einer entgasten Ethanol-Wasser-Lösung bei geringerer Flussrate gespült.
Nach der Behandlung kann es bei Raumtemperatur oder bei 4–8 sein °C über einen längeren Zeitraum gelagert werden. Die Chromatographiesäule muss während der Lagerung vollständig verschlossen sein, um Feuchtigkeitsverlust und Austrocknung zu verhindern.
Das derzeit nicht verwendete Medium muss in 20%iger Ethanol-Lösung aufbewahrt werden. Alle Ionenaustauscher-Trennmedien sollten bei 4 liegen °C bis 30 °C gelagert und vor Frost geschützt werden.
Die Trennung und biologische Reinigung von Makromolekülen mittels Ionenaustauschchromatographie beruht im Wesentlichen auf der Dissoziation verschiedener Moleküle, der Nettoladung der Ionen und den Unterschieden in der Oberflächenladungsverteilung zur selektiven Trennung. Sie hat sich zu einer der am häufigsten angewandten Reinigungstechniken für biochemische Produkte, Proteine, Peptide und andere Substanzen entwickelt.
Seplife ® Dextranbasierte Ionenaustauscher-Chromatographieharze:
Das Seplife ®Bei Dextran-Ionenaustauscher-Chromatographieharzen wird die Dextranmatrix von Gelfiltrationschromatographieharzen der G-Serie (Seplife G-25 und Seplife G-50) verwendet, wobei die Ionenaustausch-Funktionsliganden mit unterschiedlichen Eigenschaften fest an die vernetzte Dextranmatrix gebunden sind.
Dextran-Ionenaustauscherharze werden üblicherweise als Trockenpulver gelagert und müssen vor dem Gebrauch gequollen werden. Sie finden breite Anwendung bei niedermolekularen Proteinen wie Prothrombin und niedermolekularem Heparin.
Dextran-Ionenaustauscher-Chromatographieharze von Sunresin:
DEAE Seplife ® A25/A50
Q Seplife ® A25/A50
CM Seplife ® C25/C50
SP Seplife ® C25/C50
Seplife ® Ultraschnell fließende Agarose-basierte Ionenaustauscher-Chromatographieharze (BB):
Diese Seplife-Serie ®Ionenaustauscher-Chromatographieharze werden durch Anbindung von Ionenaustauscherliganden an Agarose-Mikrokügelchen mit einer Partikelgröße von 100–300 µm hergestellt. Der Gegendruck ist bei der gegebenen Flussrate relativ gering. Bei Proben mit hoher Viskosität und Trübung kann die Effizienz durch den Einsatz dieser Harze verbessert werden.
Sunresins ultraschnelle Agarose-Ionenaustauscher-Chromatographieharze:
DEAE Seplife ® BB
Q Seplife ® BB
CM Seplife ® BB
SP Seplife ® BB
Seplife ® Schnellfließende Agarose-basierte Ionenaustauscher-Chromatographieharze (FF):
Diese Seplife-Serie ® Die Harze verwenden Agarose-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 45–165 µm als Matrix, die mit verschiedenen funktionellen Gruppen gebunden sind. Der Partikelgrößenbereich ermöglicht ein breites geeignetes Anwendungsspektrum. Sie werden häufig in verschiedenen Stufen der Anreicherung, Zwischenreinigung und Endreinigung biologischer Produkte eingesetzt.
Sunresins schnellfließende Agarose-Ionenaustauscher-Chromatographieharze:
DEAE Seplife ® FF
Q Seplife ® FF
CM Seplife ® FF
SP Seplife ® FF
Seplife ® Hochauflösende Agarose-basierte Ionenaustauschchromatographie-Harze (HP):
Diese Serie verwendet 25-45µm große Agarose-Mikrokügelchen als Matrix und wird durch Anbindung verschiedener funktioneller Gruppen hergestellt.
Die geringe Partikelgröße ermöglicht eine höhere Auflösung der Harze, und sie werden häufig zur Feintrennung und Präparation kleinerer Probenmengen eingesetzt.
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Hochauflösende Agarose-Ionenaustauscher-Chromatographieharze von Sunresin:
DEAE Seplife ® HP
Q Seplife ® HP
CM Seplife ® HP
SP Seplife ® HP
Ultrahochkapazitäts-Agarose-Ionenaustauscher-Chromatographieharze (XL):
Die spezielle „Tentakel“-Struktur der Agarose-Mikrokügelchen verringert den Einfluss sterischer Behinderung bei der Bindung an Biomoleküle, und die Liganden werden gleichmäßiger verteilt, was eine extrem hohe Beladung und eine sehr hohe Kosteneffizienz ermöglicht.
Sunresins Agarose-Ionenaustauscher-Chromatographieharze mit ultrahoher Kapazität:
DEAE Seplife ® XL
Q Seplife ® XL
CM Seplife ® XL
SP Seplife ® XL
Seplife ® Hochsteife Agarose-Ionenaustauscher-Chromatographieharze (Großmaßstab):
Das hochsteife (großskalige) Agarose-Ionenaustauschermedium von Sunresin weist eine maximale Druckbeständigkeit von 0,5 MPa, eine maximale Durchflussrate von 1000 cm/h und eine schnellere Stoffaustauschrate auf, was eine deutlich verbesserte Effizienz bei der großtechnischen Produktion ermöglicht.
Je nach Partikelgröße der Matrix wird das hochsteife Agarose-Ionenaustauschmedium von Sunresin in hochsteifes Medium mit hoher Durchflussrate (Large Scale) und hochsteifes Medium mit hoher Auflösung (Large Scale HP) unterteilt.
Hochsteife Agarose-Ionenaustauscher-Chromatographieharze von Sunresin (Großmaßstab):
DEAE Großmaßstab /HP
Q Großmaßstab /HP
CM Großmaßstab /HP
SP Großmaßstab /HP
Seplife ® Polystyrol-Ionenaustauscher-Chromatographieharze mit einheitlicher Partikelgröße (LXMS):
Seplife ®Die Ionenaustauscher-Chromatographieharze vom Typ IEX LXMS bieten zwei Porengrößen (50 nm, 150 nm) und drei Partikelgrößen (15, 30 und 50 µm) aus Polystyrol mit einheitlicher Partikelgröße. Dank ihrer hohen Vernetzungseigenschaften halten die Harze einem höheren Betriebsdruck (3 MPa).
Die beiden Porengrößen von 50 nm und 150 nm decken die Anwendung der Anreicherung, Zwischenreinigung und Feinreinigung von Antikörpern, Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Antibiotika, Naturstoffen und anderen Produkten mit unterschiedlichen Molekulargewichten ab.
Sunresin bietet Polystyrol-Ionenaustauscher-Chromatographieharze mit einheitlicher Partikelgröße an:
Seplife ® LXMS 15Q/15S (Partikelgröße 15 µm, Porengröße 50 nm)
Seplife ® LXMS 30Q/30S (Partikelgröße 30 µm, Porengröße 50 nm)
Seplife ® LXMS 50Q/50S (Partikelgröße 50 µm, Porengröße 100 nm)
Seplife ® LXMS 50HQ/50HS (Partikelgröße 50 µm, Porengröße 150 nm)
Seplife ® Polymethylacrylat-Ionenaustauscher-Chromatographieharze (LXPM):
Diese Gruppe von Ionenaustauscher-Chromatographieharzen besteht aus Mikrokügelchen mit Polymethacrylat als Matrix, die mithilfe der einzigartigen Polymersynthesetechnologie von Sunresin hergestellt werden. Die Mikrokügelchen werden durch präzise Porenbildung und hydrophile, langkettige Makromoleküle an der Oberfläche modifiziert und mit verschiedenen Ionenaustauschgruppen gekoppelt.
Aufgrund ihrer guten Hydrophilie, chemischen und physikalischen Stabilität sowie ihrer starren Struktur weisen Ionenaustauscher-Chromatographieharze eine gute Biokompatibilität und lange Lebensdauer auf und verbessern die Reinigungseffizienz. Sie eignen sich für Produktions- und Reinigungsstufen wie die Anreicherung, Zwischenreinigung und Feinreinigung von Molekülen wie Antikörpern, Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Antibiotika und Naturstoffen und bieten Kunden eine Komplettlösung für die industrielle Produktion biologischer Proben.
Polymethylacrylat-Ionenaustauscher-Chromatographieharze von Sunresin:
Seplife ® LXPM CM/DEAE/SP/Q 650M (stark hydrophil, Partikelgröße 80 µm) ）
Seplife ® LXPM CM/DEAE/SP/Q 650S (stark hydrophil, Partikelgröße 50 µm) ）
Seplife ® LXPM CM/DEAE/SP/Q 706 (stark hydrophob) ，Stark ionisch, multimodal, Partikelgröße 80 µm ）
Seplife ® LXPM CM/DEAE/SP/Q 5504 （starke Hydrophobie ，hochauflösend, stark ionisch, multimodal, Partikelgröße 80 µm)
Für weitere Informationen zu den verschiedenen Arten von Ionenaustauscher-Chromatographieharzen kontaktieren Sie uns bitte unter (info.lifescience@sunresin.com).
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