Auswahl von Ionenaustauschchromatographiemedien
Die Trennung und Reinigung von Biomakromolekülen mittels Ionenaustauschchromatographie beruht hauptsächlich auf der Ausnutzung der Dissoziationseigenschaften verschiedener Moleküle, der Nettoladung der Ionen und der elektrischen Unterschiede in der Oberflächenladungsverteilung. Sie hat sich zu einer der am häufigsten angewandten Reinigungstechniken für die Trennung und Reinigung von Biochemikalien, Proteinen, Peptiden und anderen Substanzen entwickelt.
Bei der Trennung und Reinigung muss die Säule eine hohe Beladungskapazität, einfache Bedienung und lange Lebensdauer aufweisen. Das Trennmedium ist dabei der wichtigste Faktor. Daher ist die Auswahl des Mediums Trenns von besonderer Bedeutung.
1. Sortenauswahl:
Ein geeignet
Ionenaustauschchromatographiemedium
Die Auswahl des Trennmediums sollte sich nach der Art der Ladung, der Molekülgröße, den physikochemischen Eigenschaften und der Mikroumgebung des zu trennenden und zu reinigenden Zielprodukts richten. Bei anorganischen kleinen Molekülen ist die Wahl des Trennmediums relativ einfach, bei Biomakromolekülen müssen jedoch mehr Faktoren berücksichtigt werden.
Biomakromoleküle wie Proteine bestehen aus einer Vielzahl von Aminosäuren, die unter verschiedenen pH-Bedingungen unterschiedliche elektrische Eigenschaften aufweisen. Sie haben spezifische Anforderungen an das optimale pH-Milieu. Daher ist es notwendig, zunächst das Zielprotein, seinen elektrischen Punkt und die geeignete Mikroumgebung zu verstehen, um anschließend den passenden Ionenaustauscher auszuwählen.
Die Wahl zwischen einem Kationen- und einem Anionenaustauscher hängt hauptsächlich von der Ladung des zu trennenden Materials bei seinem stabilen pH-Wert ab. Ist es positiv geladen, wählt man den Kationenaustauscher; ist es negativ geladen, den Anionenaustauscher. Beispielsweise liegt der isoelektrische Punkt des zu trennenden Proteins bei 4, und der stabile pH-Bereich liegt zwischen 6 und 9. Da das Protein in diesem Bereich negativ geladen ist, sollte für die Trennung ein Anionenaustauscher verwendet werden.
2. Skelettauswahl:
Der Matrix-Ionenaustauscher sollte entsprechend der Ausbeute des Zielprodukts, der erforderlichen Reinheit und dem wirtschaftlichen Wert ausgewählt werden.
Das universell einsetzbare Polystyrol-Ionenaustauscherharz zeichnet sich durch eine stabile Struktur, einen niedrigen Preis und eine hohe Gesamtaustauschkapazität aus und eignet sich für die Extraktion und Trennung von biochemischen Produkten wie Antibiotika, organischen Säuren, tierischen oder pflanzlichen Rohstoffen. Für einige hochwertige gentechnisch hergestellte Produkte, die eine hohe Auflösung und Reinheit erfordern, werden weiterhin biochemische Trennmedien auf Cellulose-, Dextran- und Agarosebasis benötigt.
Cellulose-Ionenaustauscher sind relativ preiswert, weisen jedoch eine geringe und Stabilität auf und eignen sich für die erste Trennung und die Herstellung größerer Mengen. Dextran-Ionenaustauscher bieten eine moderate Auflösung und sind preislich im Mittelfeld, reagieren jedoch stark auf äußere Einflüsse. Ihr Volumen kann sich mit der Ionenstärke und dem pH-Wert erheblich verändern, was die Auflösung beeinträchtigt. Agarose-Ionenaustauscher zeichnen sich durch gute mechanische Stabilität und hohe Auflösung aus, sind aber teuer.
Das ideale Trennmedium sollte nicht nur leicht adsorbiert, sondern auch leicht eluierbar sein. Ist das Zielprodukt unempfindlich gegenüber Änderungen der Ionenstärke und des pH-Werts, kann ein starkes Medium mit hoher Ladung oder hoher Alkalinität und hoher Ladungsdichte in Betracht gezogen werden. Bei gegenüber diesen Faktoren sind schwache oder schwach alkalische Medien zu verwenden. Adsorbierte makromolekulare Substanzen bilden relativ starke Bindungen, was die Elution erschwert. Werden aggressive Bedingungen, die zur Denaturierung von Makromolekülen führen, ist ein Medium mit geringer Dichte an angewandten Gruppen zu wählen.
Stark saure oder stark alkalische Medien mit einem breiten pH-Bereich werden häufig zur Trennung kleiner Moleküle oder bei extremen pH-Werten eingesetzt. Aufgrund ihrer starken elektrischen Eigenschaften können sie jedoch empfindliche Biomoleküle leicht denaturieren oder zerstören. Schwach saure oder schwach alkalische Medien weisen eine hohe Selektivität auf und inaktivieren Proteine nur schwer. Daher eignen sie sich im Allgemeinen zur Trennung von Makromolekülen wie Proteinen, ihr pH-Bereich ist jedoch eng.
3. Auswahl der Partikelgröße:
Die Größe des Trennmediums hat einen signifikanten Einfluss auf die Auflösung und die Flussrate der Ionenaustauschchromatographiesäule. Im Allgemeinen weisen Trennmedien mit kleiner Partikelgröße eine hohe Auflösung auf, benötigen jedoch eine lange Zeit, um das Gleichgewicht einzustellen, und weisen eine geringe Flussrate auf. Bei großer Partikelgröße ist die Flussrate relativ hoch und der Druckabfall gering, jedoch sind Auflösung und Beladung gering. Daher eignen sich Trennmedien mit großen Partikeln für die präparative Trennung im großen Maßstab, bei der keine hohe Auflösung erforderlich ist, während Trennmedien mit kleinen Partikeln für die Feintrennung mit hoher Auflösung oder für die Produktaufbereitung geeignet sind.
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