Elution und Regeneration
Wenn das chromatographische Medium erschöpft ist, muss es eluiert werden. Das Grundprinzip besteht darin, das Zielprodukt durch ein aktives Ion oder eine aktivere Gruppe zu desorbieren. Verschiedene Sorptionsmittel unterscheiden sich in ihrer Aktivität. Daher muss ein geeignetes Elutionsmittel ausgewählt werden, um das Protein zu eluieren.
Chromatographiemedien
Sterben
Es gibt im Wesentlichen drei Möglichkeiten, bei der Ionenaustauschchromatographie zu eluieren:
Eine Methode dient der gleichzeitigen Elution. Als Elutionsmittel kann eine verdünnte Säure, Lauge oder Salzlösung verwendet werden, alternativ kann auch ein geeignetes organisches Lösungsmittel eingesetzt werden. Salz kommenlösungen dabei am häufigsten zum Einsatz. Die Darreichungsform wird entsprechend der Eigenschaften des Zielprodukts und des Endprodukts gewählt. Da die zu absorbierende Substanz oft nicht aus einer einzigen Spezies besteht, unterscheiden sich die Ladungen der einzelnen Substanzen und ihre Bindungsstärke an das Medium. Selbst bei Verwendung desselben Elutionsmittels diffundiert die leicht austauschbare Substanz aufgrund ihrer starken Bindungskraft zunächst aus dem Medium. Nach der Elution können die verschiedenen Substanzen durch Fraktionierung getrennt werden, um ein relativ reines Produkt zu erhalten. Diese Methode wird häufig zur Trennung eingesetzt, wenn die Eigenschaften des Zielprodukts gut bekannt sind, oder zur Trennung von analytischen Substanzen.
Die zweite Methode ist die stufenweise Elution, dh die Elution mit Salzlösungen unterschiedlicher Konzentrationen. Trennmedium: Während des Austauschadsorptionsprozesses werden verschiedene Proteine adsorbiert. Bei Verwendung konstanter Elutionsbedingungen ist es manchmal nicht möglich, alle Komponenten vollständig zu trennen, weshalb eine Anpassung der Elutionsbedingungen erforderlich ist. Dies kann stufenweise erfolgen, indem verschiedene Elutionsmittel oder Elutionsmittel mit unterschiedlichen pH-Werten verwendet werden. Je nach Konzentration und pH-Wert des Elutionsmittels lassen sich so unterschiedliche Elutionspeaks erzielen. Das heißt, mit einer bestimmten Salzkonzentration kann ein Zielprotein isoliert werden, und mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen lassen sich verschiedene Zielproteine isolieren. Diese stufenweise Elutionsmethode eignet sich besonders für die Trennung von Proteinen bekannter Natur, insbesondere für die Produktion im größeren Maßstab, und ist einfach zu handhaben und zu steuern.
Die dritte Methode ist die kontinuierliche Gradientenelution. Dabei wird die Ionenstärke oder der pH-Wert des Eluats linear verändert (im Allgemeinen nur in Sonderfällen bei pH-Wert-veränderlichen Elutionsverfahren). Im Elutionsprozess werden verschiedene Proteine nacheinander ausgetauscht, um verschiedene Proteinkomponenten zu gewinnen. Gleichzeitig wird eine Protein-Auseinandersetzung vermieden. Die Gradientenelution ist die am häufigsten verwendete Elutionsmethode in der Ionenaustauschchromatographie und zeichnet sich durch ihre hohe Elutionsleistung aus. Sie eignet sich besonders für die Elution von Komponenten mit ähnlichen Ladungseigenschaften.
Beim Elutionsprozess kann entweder Gleichstrom- oder Gegenstromelution eingesetzt werden. Bei der Gleichstromelution, auch Vorwärtselution genannt, fließt das Elutionsmittel in die gleiche Richtung wie das Arbeitsmedium. Bei der Gegenstromelution, auch Rückstromelution genannt, fließt das Elutionsmittel entgegengesetzt zum Arbeitsmedium. Wird die Zufuhrflüssigkeit in einer Austauschkolonne von oben nach unten ausgetauscht und adsorbiert, ist die Adsorbatkonzentration in der oberen Schicht höher als in der unteren. Die anschließende Desorption des Eluats von unten nach oben ermöglicht eine effizientere Elution. Da die Rückstromelution jedoch deutlich komplexer ist als die Vorwärtselution, wird sie meist als positive Elutionsmethode angewendet.
Die Flussrate des Eluenten beeinflusst die Trennung in der Ionenaustauschchromatographie und wird üblicherweise konstant gehalten. Im Allgemeinen ist die Auflösung bei langsamer Elution besser als bei schneller. Eine zu niedrige Elutionsrate führt jedoch zu langen Trennzeiten, Nebenwirkungen wie Probendiffusion, Verbreiterung der Spektralpeaks und einer reduzierten Auflösung. Daher ist die Wahl der geeigneten Elutionsrate situationsabhängig. Sind die Elutionspeaks in einem bestimmten Bereich konzentriert und überlappen sich, sollte der Gradientenbereich entsprechend verkleinert oder die Elutionsgeschwindigkeit reduziert werden, um die Auflösung zu verbessern. Ist die Auflösung gut, der Elutionspeak aber zu breit, sollte die Elutionsrate entsprechend erhöht werden.
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