Nickelchelat -Agarose -Chromatographieharz
Ni Seplife 6ff (IDA) Anweisungen
Ni -Chelat -Agarose -Chromatographie (IDA) bindet Iminodiakesäure an 6FF -Agarose -Medien und dann das Ion von Ni2+ das Ion als ein sein Affinität Chromatographische Medien. Es wird weit verbreitet für die Verarbeitung von Protein, Nukleinsäure Und Polypeptidreinigung in Down Stream von Biopharming und Bioengineering.
| Harzcode | Ni Seplife® 6ff (IDA) |
| Aussehen | Kugel -Gel -Perlen |
| Partikelgröße (μm) | 45 ～ 165 |
| Matrix | Seplife 6ff |
| Durchflussrate (cm/h) | ≥370 |
| Druck (MPA) | 0.3 |
| Ionenbindungskapazität | (Ni2+ Umol/ml): ~ 15 |
| Lineare Flussrate Referenz | 60 cm/h |
| pH -Stabilität | 3 ~ 13 (langfristig), 2 ~ 14 (kurzfristig, CIP) |
| Anwendung | His-Tag-Proteinreinigung |
| Chemische Stabilität | Stabil in Wasserpufferlösung, 0,1 mol/l NaOH; 0,01 mol/l HCl; 8 mol/l Carbamid |
1. Verpackung
(1) Das gesamte Material und das Reagenz bei Raumtemperatur, die den anfänglichen Puffer und die Elution vorbereiten.
(2) Nehmen Sie die Harzprobe gemäß der Säulengröße, waschen Sie 20% Ethanol zum Trocknen aus, verwenden Sie Puffer (das Verhältnis von Harz: Puffer = 3: 1), um in Homogenat- und Entgasung behandelt zu werden.
(3) Verwenden Sie Wasser oder Puffer, um in der Säule nass zu bleiben. Der Wasser- oder Pufferspiegel sollte höher sein als die Filtermambran und stellen Sie sicher, dass der Boden der Säule ohne Bobble die Säule versichert.
(4) Verwenden Sie ein Glasstab, um das Homogenat in die Säule zusammen mit der inneren Säulenfläche zu führen, um eine Blase zu vermeiden. Öffnen Sie das Säulenauslassventil, um das Harz frei abzulegen, und verbinden Sie die Spalten -Oberkappe gut.
(5) Öffnen Sie die peristaltische Pumpe und verwenden Sie den Puffer, um die Säule mit einem 1,33 -fachen Durchfluss zu durchqueren als die Durchflussrate des Puffernormalens. Verwenden Sie 2-3BV-Puffer, um die Säulenbilanz zu erstellen.
2. Gleichgewicht
Bilanz mit 2 ~ 5 Bettvolumina der Anfangspufferlösung, bis die Leitfähigkeit, der pH -Wert und andere Parameter unverändert sind.
3. Beispielbelastung
(1) Die Probe ist im Allgemeinen im Anfangspuffer von pH 6-8 gelöst, und das Erhöhen des pH-Werts des Belastungspuffers kann die Belastung erhöhen.
(2) Der Puffer sollte nicht EDTA und Citrat enthalten, und es ist am besten, Verringerung von Wirkstoffen wie Mercaptoethanol und DTT zu vermeiden.
(3) Die häufig verwendete Pufferlösung hat 10 bis 100 mmol/l Natriumphosphatpufferlösung, 20 bis 200 mmol/ltris-HCl-Pufferlösung.
(4) 0,15 bis 0,5 mol/l NaCl werden im Puffer im Allgemeinen hinzugefügt, um den Ionenaustausch zu beseitigen.
(5) Wenn erstmals ein Nickel -Chelat -Agarosegel verwendet wird, wird empfohlen, 50 mmol/l PBS (50 mmol/l NAH2PO4, 0,5 mol/l NaCl, pH 7,4) als Anfangspuffer zu verwenden.
4.selution
Die Elution ist im Allgemeinen in die folgenden Methoden unterteilt:
(1) PH-Elution reduzieren: Die meisten Proteine werden bei pH 6-4 (auch bei pH 3-4) eluiert, und der Puffer kann Natriumacetat-, Zitronensäure- und Phosphatpuffersysteme sein.
(2) Wettbewerbselution: Linear erhöht oder erhöht die Konzentration konkurrierender Substanzen mit Affinität zu Metallionen (z. B. 0-0,5 mol/l Imidazol, 0-50 mmol/l Histidin, 0-2 mol/l NH4CL).
. Diese Methode kann jedoch verschiedene Proteine nicht trennen und beeinflusst die Adsorption von Proteinen, was zur Unfähigkeit des Fusionsproteins zum Aufhängen führt.
(1) Wenn zum ersten Mal die für die Elution erforderliche Konzentration von Imidazol unsicher ist, wird empfohlen, 10 mmol/l, 20mmol/l, 50 mmol/l, 100 mmol/l, 200mol/l, 500 mmol/l bis hinz hinzuzufügen der anfängliche Puffer. Das Imidazol wurde eluiert und von niedrig bis hoch gesammelt, und die eluierten Ergebnisse wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese identifiziert.
(2) Das Imidazol ist alkalisch und der pH wird mit HCl eingestellt, nachdem der entsprechende Puffer hergestellt wurde.
(3) Durch die Senkung der PH-Elution und das Elutieren des Chelatmittels fallen die Metallionen ab und die Metallionen müssen vor dem nächsten Gebrauch wieder in Richtung Chelating gestellt werden.
(4) Bedingt kann eine lineare Imidazol -Gradientenelution durchgeführt werden, um die bevorzugten Elutionsbedingungen zu bestimmen.
Für die oben genannten Elutionsmethoden müssen dem Puffer 150 bis 500 mmol/l NaCl hinzugefügt werden, um den Ionenaustausch zu beseitigen.
5. REGENERATION
(1) Das Gel muss nach wiederholtem Gebrauch oder wenn es notwendig ist, die chelatierten Metallionen zu ersetzen. Nickelentfernungsmethode: Spülen Sie zunächst die Säule mit 5 bis 10 Bettmengen aus destilliertem Wasser aus, spülen Sie dann die Säule mit 5 bis 10 Bettvolumina von 100 mmol/ l EDTA und verwenden Auswärtsreste EDTA.
(2) Die Säule, die für mehrmals im Allgemeinen verwendet wird, muss nach dem Entfernen von Nickel gereinigt werden. Reinigungsmethode: Umgeben Sie die Säule mit 0,1 ~ 1,0 mol/l NaOH und halten Sie sie 1 ~ 2 h bei 50 cm/h, können Sie nicht nur die starken Verunreinigungen entfernen, sondern auch die Wärmequelle entfernen.
(3) Nach dem Reinigen Metallionen wieder unterscheiden. Chelationsmethode: Zunächst wird die Säule nach der Entfernung von Nickel vollständig mit 2 bis 5 Bettvolumina destilliertes Wasser äquilibriert, und dann wird 0,1 bis 0,3 mol/l Metallsalzlösung verwendet, um 5 bis 10 Bettvolumina zum Chelat -Metallionen zu bestehen. Spülen Sie mit 5 bis 10 Bettvolumina destilliertes Wasser ab, um unzählige Metallionen zu entfernen.
6.Cip
(1) Entfernung von Proteinen, die durch Ionenaustausch adsorbiert wurden: 2 bis 3 Bettvolumina wurden durch 2 mol/l NaCl -Lösung zurückgespült.
(2) Entfernung starker hydrophober Proteine und Lipide usw.: 4 Bettvolumina wurden mit 70% Ethanol oder 30% Isopropanol zurückgespült.
(3) Entfernung von ausgefälltem Protein, hydrophobe Protein: Referenzgelregenerationsschritt.
7.Storage
Versiegelt und auf 4 ~ 30 ° C (20% Ethanol in Lagerlösung) gelagert, trocken, belüftet, sauber, nicht gefroren; Gebrauchte Säulen werden in 4 ~ 8 ° C, 20% Ethanollösung, gespeichert.
Vorsicht:
(1) Die Probe und Ni Seplife®6ff (IDA) müssen sein mit dem Elutionspuffer äquilibriert Und dann gehen Sie zur Chromatographie -Spalte.
(2) Das Säulenbett muss flach, frei von Rillen und Luftblasen sein, sonst sollte es neu installiert werden.
(3) Stellen Sie bei Verwendung sicher, dass die Temperatur der Säule und des Puffers gleich ist, wodurch die Erzeugung von Blasen im Säulenbett vermieden wird und den Reinigungseffekt beeinflusst.
(4) Die Durchflussrate sollte während des Elutionsprozesses und nicht zu schnell kontrolliert werden.
(5) Während der Beladung und des gesamten Elutionsprozesses wird die Zylinderoberfläche daran hindert, auszutrocknen.
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