Ni Seplife® 6FF (IDA)

Nickel-Chelat-Agarose-Chromatographie-Harz

Anweisungen für Ni Seplife 6FF (IDA)

Produktprofil:
Ni-Chelat-Agarose-Chromatographie(IDA) bindet Iminodiessigsäure an 6FF-Agarosemedien und chelatisiert dann das Ni2 + -Ion alsaffinitätschromatographische Medien. Es ist weit verbreitet für dieVerarbeitung von Protein,NukleinsäureundPolypeptidreinigungin stromabwärts vonBiopharming und Bioengineering.

Harzparameter:

Testanweisung:
1. Säulenverpackung
(1) Das gesamte Material und Reagenz bei Raumtemperatur, wobei der anfängliche Puffer und der Elutionsbeffer hergestellt werden.
(2) Nehmen Sie eine Harzprobe gemäß Säulengröße, waschen Sie 20% Ethanol zum Trocknen aus und verwenden Sie Puffer (das Verhältnis von Harz: Puffer = 3: 1), um eine Homogenat- und Entgasungsbehandlung durchzuführen.
(3) Verwenden Sie Wasser oder Puffer, um das Innere oder den Boden der Säule feucht zu halten. Der Wasser- oder Pufferspiegel sollte höher sein als der der Filter-Mambrane.
(4) Führen Sie das Homogenisat mit einem Glasstab zusammen mit der Innenseite der Säule einmal in die Säule, um Blasenbildung zu vermeiden. Öffnen Sie das Säulenauslassventil, damit sich das Harz frei absetzen kann, und schließen Sie die obere Kappe der Säule gut an.
(5) Öffnen Sie die peristaltische Pumpe und verwenden Sie Puffer, um die Säule mit einer 1,33-fachen Durchflussrate als der normalen Durchflussrate des Puffers zu passieren. Verwenden Sie 2-3BV-Puffer, um das Spaltengleichgewicht herzustellen.
2. Gleichgewicht
Balance mit 2 ~ 5 Bettvolumina der anfänglichen Pufferlösung, bis die Leitfähigkeit, der pH und andere Parameter unverändert sind.
3. Beispiel laden
(1) Die Probe wird im Allgemeinen in dem anfänglichen Puffer mit einem pH-Wert von 6 bis 8 gelöst, und eine Erhöhung des pH-Werts des Ladepuffers kann die Beladung erhöhen.
(2) Der Puffer sollte kein EDTA und Citrat enthalten, und es ist am besten, Reduktionsmittel wie Mercaptoethanol und DTT zu vermeiden.
(3) Die üblicherweise verwendete Pufferlösung enthält 10 bis 100 mmol / l Natriumphosphatpufferlösung, 20 bis 200 mmol / LTris-HCl-Pufferlösung.
(4) Dem Puffer werden im Allgemeinen 0,15 bis 0,5 mol / l NaCl zugesetzt, um den Ionenaustausch zu beseitigen.
(5) Bei erstmaliger Verwendung eines Nickelchelat-Agarosegels wird empfohlen, 50 mmol / l PBS (50 mmol / l NaH 2 PO 4, 0,5 mol / l NaCl, pH 7,4) als Ausgangspuffer zu verwenden.
4.Lösung
Die Elution wird im Allgemeinen in die folgenden Methoden unterteilt:
(1) Reduzieren Sie die pH-Elution: Die meisten Proteine ​​werden bei pH 6-4 (auch bei pH 3-4) eluiert, und der Puffer kann Natriumacetat-, Zitronensäure- und Phosphatpuffersysteme sein.
(2) Kompetitive Elution: Lineare Erhöhung oder Erhöhung der Konzentration konkurrierender Substanzen mit Affinität zu Metallionen (z. B. 0-0,5 mol / l Imidazol, 0-50 mmol / l Histidin, 0-2 mol / l NH 4 Cl).
(3) Elution des Chelatbildners: Chelatbildner wie EDTA und EGTA können mit Metallionen reagieren und bewirken, dass das Protein eluiert. Dieses Verfahren kann jedoch keine unterschiedlichen Proteine ​​trennen und beeinflusst die Adsorption von Proteinen, was dazu führt, dass das Fusionsprotein nicht hängen kann.

Bemerkungen:
(1) Wenn bei der ersten Verwendung die zur Elution erforderliche Imidazolkonzentration ungewiss ist, wird empfohlen, 10 mmol / l, 20 mmol / l, 50 mmol / l, 100 mmol / l, 200 mmol / l, 500 mmol / l zuzusetzen der anfängliche Puffer. Das Imidazol wurde eluiert und von niedrig nach hoch gesammelt, und die eluierten Ergebnisse wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese identifiziert.
(2) Das Imidazol ist alkalisch und der pH wird mit HCl eingestellt, nachdem der entsprechende Puffer hergestellt wurde.
(3) Durch Verringern der pH-Elution und Eluieren des Chelatbildners fallen die Metallionen ab, und die Metallionen müssen vor der nächsten Verwendung erneut chelatisiert werden.
(4) Bedingt kann eine lineare Elution mit Imidazol-Gradienten durchgeführt werden, um die bevorzugten Elutionsbedingungen zu bestimmen.
Für die obigen Elutionsverfahren müssen dem Puffer 150 bis 500 mmol / l NaCl zugesetzt werden, um den Ionenaustausch zu beseitigen.
5. Regeneration
(1) Das Gel muss nach wiederholtem Gebrauch oder wenn die chelatisierten Metallionen ersetzt werden müssen, denickt und regeneriert werden. Nickelentfernungsmethode: Spülen Sie die Säule zuerst mit 5 bis 10 Bettvolumina destilliertem Wasser, dann mit 5 bis 10 Bettvolumina 100 mmol / l EDTA und verwenden Sie schließlich 2 bis 3 Bettvolumina mit 0,5 mol / l NaCl-Waschmitteln Rest EDTA weg.
(2) Die mehrfach verwendete Säule muss im Allgemeinen nach der Nickelentfernung gereinigt werden. Reinigungsmethode: Drehen Sie die Säule mit 0,1 ~ 1,0 mol / l NaOH um, halten Sie sie 1 ~ 2 h bei 50 cm / h, um nicht nur die starken Verunreinigungen zu entfernen, sondern auch die Wärmequelle zu entfernen.
(3) Nach der Reinigung Metallionen erneut chelatisieren. Chelatisierungsverfahren: Zuerst wird die Säule nach der Nickelentfernung vollständig mit 2 bis 5 Bettvolumina destilliertem Wasser äquilibriert, und dann werden 0,1 bis 0,3 mol / l Metallsalzlösung verwendet, um 5 bis 10 Bettvolumina zum Chelatisieren von Metallionen zu leiten. Mit 5 bis 10 Bettvolumina destilliertem Wasser spülen, um nicht verwandte Metallionen zu entfernen.
6.CIP
(1) Entfernung von durch Ionenaustausch adsorbierten Proteinen: 2 bis 3 Bettvolumina wurden mit 2 mol / l NaCl-Lösung zurückgewaschen.
(2) Entfernung stark hydrophober Proteine ​​und Lipide usw.: 4 Bettvolumina wurden mit 70% Ethanol oder 30% Isopropanol zurückgewaschen.
(3) Entfernung von präzipitiertem Protein, hydrophobem Protein: Referenzgelregenerationsschritt.
7. Speicherung
Versiegelt und gelagert bei 4 ~ 30 ° C (20% Ethanol in Lagerlösung), trocken, belüftet, sauber, nicht gefroren; gebrauchte Säulen werden in 4 ~ 8 ° C, 20% iger Ethanollösung gelagert.

Vorsicht:
(1) Die Probe und Ni seplife®6FF (IDA) müssen mit dem Elutionspuffer äquilibriert werden und dann zur Chromatographiesäule gehen.
(2) Das Säulenbett muss flach und frei von Rillen und Luftblasen sein, andernfalls sollte es wieder eingebaut werden.
(3) Stellen Sie bei der Verwendung sicher, dass die Temperatur der Säule und des Puffers gleich sind, vermeiden Sie die Bildung von Blasen im Säulenbett und beeinträchtigen Sie den Reinigungseffekt.
(4) Die Durchflussrate sollte während des Elutionsprozesses streng kontrolliert werden und nicht zu schnell.
(5) Während des Ladens und des gesamten Elutionsprozesses wird verhindert, dass die Zylinderoberfläche austrocknet.